• 

KIマウス作製

• 

ターゲティングストラテジーの提案からKIマウス、F1ヘテロ変異体まで

ノックインマウス作製受託サービスの概要について

図1、Red/ETテクノロジーの原理Red/ETテクノロジーを利用して（図１）、標的遺伝子のノックインターゲティングベクターを構築します。遺伝子ターゲティングにより標的遺伝子が外来遺伝子（変異型遺伝子、ヒト型全長、レポーター遺伝子など）に置換されたES細胞株（129/EVSVTac由来）を樹立します。そのES細胞株をマウス初期胚に注入してキメラマウスを作出し、さらにキメラマウスと野生型マウスを交配させて産子を得て、注入したES細胞株から分化した精子に由来するF１マウスを選択します。これらのF1マウスのうち、構成遺伝子が欠損した標的遺伝子座を持つヘテロミュータントマウスを、サザン解析により選択します。

標的遺伝子のゲノムクローンの探索

図２、129系統マウスの標的遺伝子クローンのスクリーニング１、標的遺伝子座近傍の特異性の高いゲノムDNA配列を選択、クローニングして、プローブDNAフラグメントを調製します ２、ハイブリダイゼーション法により、129系統マウスの全ゲノムをカバーするBACライブラリーをスクリーニングします ３、標的遺伝子を含む129系統マウスのBACクローンを複数取得します(図２） ４、取得したBACクローンに、ターゲティングベクター構築に必要な標的遺伝子のゲノムDNA配列が全て含まれるかどうかを、PCRで確認します

Red/ETテクノロジーを利用したノックインターゲティングベクターの構築

図３、Red/ETを利用したノックインターゲティングベクターの構築１、Red/ETを利用して、遺伝子ターゲティングを行なうゲノム領域の近傍のイントロン領域に、loxP配列で挟まれたPGK-Neoセレクションマーカーを挿入した組み換えBACクローンを構築します（図３） ２、挿入する外来遺伝子のDNA配列をプラスミドベクターにサブクローニングし、外来遺伝子のトランスファーフラグメントを構築します ３、Red/ETを利用して、標的遺伝子を含むBACクローンにトランスファーフラグメントを正確に挿入し、「ノックイン遺伝子座」を持つ組み換えBACクローンを構築します ４、Red/ETを利用して、「ノックイン遺伝子座」を持つ組み換えBACクローンから、遺伝子ターゲティングベクターに使用するゲノム配列のみをプラスミドベクターにサブクローニングして、ノックインターゲティングベクターを構築します

「ノックインES細胞株」の樹立

図４、サザンハイブリダイゼーションによるES細胞株の選別１、ES細胞にターゲティングベクターを導入し、G418耐性株を樹立します ２、サザンハイブリダイゼーションにより、ターゲティングを受けた遺伝子座が検出される細胞株を選択します（図４） ３、環状のCre発現ベクターを導入して一時的に発現させ、loxP配列で挟まれたPGK-Neoカセットが除去された細胞株を樹立します ４、サザンハイブリダイゼーションにより、ノックイン遺伝子座が検出される細胞株を選択します ５、選択された「ノックインES細胞株」の核型（染色体の数）を確認します

キメラマウスの作製

お手持ちのターゲットES細胞株でキメラ作製を支援します

○ES細胞の送付

細胞輸送用のドライシッパーをご送付いたします。1,000,000 cell／mlバイアルの濃度で凍結保存したご依頼のＥＳクローン（3バイアル以上）をご提供頂きます。細胞輸送用のドライシッパーをご送付いたしますので細胞を詰めご返送頂きます。

○細胞の検査

受け入れたESクローンのうち各1バイアルをＭＨＶ、マイコプラズマ検査（費用別途）に外注いたします。非汚染が確認してから実験を受注させて頂きます。 　　※別途、ご要望によりES細胞の染色体数検査を実施いたします。

○標準受託規模

ES細胞注入胚50個をレシピエントマウスに移植する事を基本単位として おります。ご依頼に応じて実験規模をカスタマイズいたします。

○作業工程

（1）ES細胞注入胚を移植したレシピエント動物のお引き渡し （2）分娩産子のお引き渡し

別途ご提供頂くフィーダー細胞やES培地の使用には対応させて頂きます。